基础知识背景 — 什么是小G蛋白？  

 小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同时具有GTP酶活性，小G蛋白家族成员在细胞信号通路中发挥分子开关的功能，参与调控很多生物学过程。小G蛋白的共同特点是，当结合了GTP时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当GTP水解成为GDP时（自身为GTP酶）则恢复到非活化状态。这一点与G蛋白里的Gα类似，但是小G蛋白的分子量明显低于Gα。 在细胞中存在着一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鸟苷酸解离抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。 第一个被发现的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的产物。小G蛋白的Ras超家族由超过150个成员组成，基于它们的序列同源性，被分成若干亚家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。  

 

Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；Rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；Rab蛋白则参与调控细胞内膜交通（membrane traffic），其他家族成员也在细胞信号通路中发挥着非常重要的作用。因此，研究GTP酶（GTPase）的活化调控机制具有广泛而深远的生物学意义。传统检测Rho 蛋白活化水平的方法主要为pull-down检测。pull-down法往往存在耗时长、需要样本量大、不太适合高通量检测等缺点。为克服传统方法这些方面的缺点，Cytoskeleton公司开发了新一代的G-LISA™检测方法，用于快速简便地检测GTP酶活化水平。G-LISA实验原理及操作步骤    1.首先将效应蛋白的受体结合域（RBD）包被96孔板；2.样本中GTP(活化状态)结合形式的蛋白分子则可结合到板上，而GDP(无活性状态)结合形式蛋白则不结合；3.洗去未结合的蛋白；4.然后依次加入特异性的一抗和HRP-二抗进行孵育结合；5.最后利用合适的酶底物OPD或化学发光试剂显色。 Swiss 3T3 细胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右） G-LISA法对比传统的pull down，主要有操作简便、上样量少、可同时检测多个样本、反应时间短、定量结果准确、与小鼠、大鼠和人的组织和细胞兼容等优势。   小G蛋白活化检测试剂盒Pull-down实验结果展示：  Lanes 4 & 5:10 ng/ ml of EGF， 2minLanes 2 & 3: Persistent serum starvationLanes 1: 20 ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standard   小G蛋白活化检测试剂盒G-LISA实验结果展示：分别用CN01（蓝色Activators）和LPA（红色）处理后RhoA的活化进程